جداسازی، کلونینگ و تعیین توالی پروتئین انتقال دهنده هگزوز2 (hxt2p) در ساکارومایسس سرویزیه سویه ایرانی

وابستگی کشورهای پیشرفته به نفت و وقوع بحرانهای نفتی در دهه 1970 به علت فزونی مصرف بر تولید و افزایش فوق العاده قیمت نفت کشورهای صنعتی را بر آن داشته که با مساله انرژی برخورد متفاوتی کنند. در حال حاظر اتانول می تواند به عنوان یک منبع قابل اعتماد سوخت مطرح باشد. اتانول در هر کشوری با توجه به منابع آن کشور قابل تولید است مثلاً در ایران از ملاس در آمریکا از ذرت در اروپا از سیب زمینی و غیره.... اتانول بدست می آورند. در فرآیند تخمیر الکل علاوه بر بهینه سازی محیط کشت و همچنین پارامترهای موثر بر تخمیر الکلی باید به میکروارگانیسم، تبدیل کننده قند به الکل نیز توجه کرد. بطوری که از طریق مهندسی ژنتیک می توان اقدام به دستکاری ژنتیکی میکروارگانیسم کرد تا از این طریق میزان تولید الکل را بهینه کنیم. در طول تخمیر مقدار زیادی هگزوز ( l/ g160 -300 ) از جمله گلوکز و فروکتوز به نسبت مساوی تبدیل به الکل ودی اکسید کربن می شوند. ساکارومایسس سرویزیه دارای 20 ژن انتقال دهنده هگزوز ( hxt) می باشند که انتقال هگزوزهایی مانند گلوکز، فروکتوز و مانوز را از طریق انتشار تسهیل شده بر عهده دارند که با بیان این ژن ها می توان میزان تولید الکل را طی فرآیند تخمیر توسط ساکارومایسس سرویزیه افزایش داد. خانواده انتقال دهنده هگزوز در مخمر شامل پروتئین های ,gal2p ,hxt1p-hxt17p snf3pو rgt2pمی باشند. snf3p و rgt2p پروتئین های همولوگ هستند که بعنوان دریافت کننده ( حسگر ) هگزوز خارج سلولی عمل کرده و سیگنال درون سلولی را جهت تحریک بیان ژنهایhxt ایجاد می کنند. هر دو این ژنها در سطوح خیلی کمی بیان می شوند و به عنوان حسگر گلوکز با میل ترکیبی پایین عمل می کنند. الگوی بیان این ژنها به شدت تابع ویژگی های کینتیک انتقال دهنده ها می باشد. بطوریکه hxt1p در شروع تخمیر بیان شده و در طی فرآیند تخمیر نقشی ندارد. حمل کننده hxt3p در سرتاسر طول تخمیر فعال بوده و حداکثر بیان را در هنگام توقف رشد نشان می دهند و hxt6p وhxt7p حمل کننده های با میل ترکیبی بالا هستند که میزان بیان شبیه به هم دارند. که این حمل کننده ها در فاز سکون رشد مخمر، بیانشان تحریک شده و در طی این فاز بیان ثابتی دارند. پایداری بیان بیشتر این ژنها حتی در کمبود نیتروژن نیز بالا است. انتقال دهنده hxt2p به طور موقتی در طول فاز تاخیر بیان شده و حداکثر بیان را در آغاز تخمیر نشان می دهند. هدف از این مطالعه بررسی میزان تولید الکل از طریق بیان بیشتر ژنهای hxt میباشد. چون در غلظت کم گلوکز، مخمر دچار گرسنگی شده و بهره دهی به شدت کم می شود و با افزایش بیان ژنهای hxt می توان میزان تولید الکل را بهینه کرد. در این تحقیق پس از تهیه پرایمرهای اختصاصی قطعه ای از ژن مورد نظر با روش pcr تکثیر یافت و با استفاده از ژل آگاروز محصول pcr را الکتروفروز کرده و اندازه ژن تکثیر شده را با استفاده از نشانگر تعیین کردیم. محصولpcr را با استفاده از کیت تجاری خالص سازی کرده و سپس به کمک آنزیم t4 dna ligase محصولpcr را به داخل وکتور ptz57r/t درج کردیم. پس از انتقال ptz57r/thxt2 به درون باکتری حد واسط استرین dh5α اشیرشیاکلی ، پلاسمید نوترکیب با روش هضم آنزیمی و نرم افزاری مورد ارزیابی قرار گرفت. ژن hxt2 به طول 1621 جفت باز، با توالی صحیح کلون گردید. هضم آنزیمی با موفقیت انجام شد. بدین ترتیب که ژنhxt2 به طور کامل از پلاسمید جدا گردید. نتایج نشان داد که وکتور ptz57r/t و استرین dh5? اشیرشیاکلی بکار رفته در این تحقیق برای نگهداری ژن hxt2 مناسب می باشد. بررسی نرم افزاری حاکی از آن بود که این ژن پروتئینی به وزن مولکولی 59/840کیلو دالتون را کد کرده و دارای 541 اسید آمینه و نقطه ایزوالکتریک 8/3 می باشد. در این مطالعه ژن hxt2 از طریق بهینه سازی pcr از سویه ساکارومایسس سرویزیه ایرانی جدا و در یک میزبان پروکاریوتیک کلون کردیم. این اولین گزارش از جداسازی و کلونینگ این ژن از طریق مهندسی ژنتیک درایران است که می تواند برای کلونینگ در وکتور بیانی به منظور افزایش راندمان تولید الکل طی فرآیند تخمیر الکلی به کار برده شود.